Đào Thị Vui, Nguyễn Thu Hằng

Mai Thị Ngoan, Đặng Thị Vân Anh, Nguyễn Quốc Huy

Trường đại học Dược Hà Nội, cục khoa học Công nghệ và đào tạo – Bộ Y tế

(Ngày gửi đăng: 15/3/2018 – Ngày duyệt đăng: 6/6/2018

hoat-tinh-estrogen
Đặt vấn đề

Sắn dây củ tròn tên khoa học là Pueraria mirifica đã được sử dụng từ rất lâu tại Thái Lan với mục đích làm đẹp và thuốc bổ cho phụ nữ. Với tác dụng tốt và giá trị kinh tế cao, sắn dây củ tròn được trồng di thực tại Việt Nam. Trong nghiên cứu trước của chúng tôi, sắn dây củ tròn di thực tại Việt Nam đã thể hiện tác dụng thông qua việc phát triển cơ quan sinh dục phụ trên chuột cống cái non. Tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen ngoài được đánh giá qua sự tăng trưởng khối lượng cơ quan sinh dục phụ còn được đánh giá qua sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo. Đây được coi là tiêu chuẩn vàng để đánh giá hoạt tính estrogen. So với phương pháp đánh giá qua sự tăng trưởng tế bào âm đạo là thuận tiện hơn và nhạy cảm hơn. Thêm vào đó, những thay đổi trên tế bào biểu mô có thể được theo dõi trong suốt quá trình thử thuốc. Bởi vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên sự tăng trưởng của tế bào biểu mô âm đạo để tiếp tục bổ sung các thông tin về tác dụng dược lý của sắn dây củ tròn.

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Nguyên liệu

Sắn dây củ tròn: Rễ củ cây sắn dây củ tròn được di thực về trồng tại Bắc Giang, được thẩm định tên khoa học là Pueraria candillei  var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdaham, (Fabaceae).

Chế phẩm nghiên cứu: Cân chính các khoảng 300,00g bột dược liệu, dược liệu được chiết bằng ethanol 70% bằng phương pháp ngấm kiệt. Khối lượng cao khô thu được là 171,5g. Tỉ lệ hàm ẩm 4,7%. Cao được bảo quản ở 2 – 8oC. Khi dùng cho chuột thí nghiệm uống, cao được hòa lại bằng nước cất với tỉ lệ thích hợp.

Liều dùng: Các mức liều dùng trong nghiên cứu được lựa chọn 100, 200mg dược liệu khô/kg chuột cống.

Động vật thí nghiệm

Chuột cống cái chửng Wistar trưởng thành, 8 tuần tuổi, khối lượng 140 – 160g, do học viện Quân Y cung cấp. Chuột sau khi mua về, được nuôi ổn định 5 ngay tại phòng thí nghiệm trước khi tiến hành nghiên cứu, chuột được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do viện vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do.

Hóa chất thuốc thử: Estradiol benzoat 1500 microgam/ml, thuốc tiêm, lô s 011012215 do công ty Harrver Việt Nam cung cấp.

Dụng cụ, máy móc thí nghiệm: Cân phân tích, Ay 220 (Shimadzu, Nhật); cân kĩ thuật J – 610C Precisa, TE412 Sartorlus (Đức); kính hiển vi kết nối máy tính (Nikon, Nhật).

Phương pháp nghiên cứu:

Tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của dịch chiết rễ Sắn dây củ tròn được đánh giá trên sự tăng trưởng tế bào âm đạo chuột cống trưởng thành cắt buồng trứng được tiến hành theo 3 bước như sau: [1], [2], [8], [9].

Bước 1: Cắt buồng trứng

Chuột cống trắng cái khỏe mạnh được chia ngẫu niên thành 2 lô: lô cắt buồng trứng và lô cắt buồng trứng giả. Tiến hành gây mê trước 10 phút bằng nải thiopental liều 40mg/kg và xylazin liều 5mg/kg, cạo bỏ phần lông tại vị trí phẫu thuật, bộc lộ buồng trứng ra ngoài. Dùng chỉ thắt chặt quanh ống dẫn trứng, cắt bỏ phần buồng trứng  giả được phẫu thuật nhưng buồng trứng không cắt mà chỉ cần kéo nhẹ và khâu lại ngay. Chuột được nuôi hồi phục 14 ngày. [7]

Bước 2: Sàng lọc sau cắt buồng trứng.

Ngày 14 – 20 sau khi cắt buồng trứng, lấy dịch tiết âm đạo để kiểm soát sự tăng trưởng các tế bào thông qua việc đánh giá sự có mặt các tế bào mô âm đạo để kiểm soát sự tăng trưởng các tế bào biểu mô âm đạo, tế bào sừng, tế bào bạch cầu đa nhân. Mẫu dịch tiết âm đạo được lấy vào khoảng 8 giờ đến 10 giờ sáng hằng ngày. Sử dụng pipet, lấy khoảng 100 micro lít muối sinh lý vào âm đạo của chuột, nhẹ nhàng 3 lần, lần cuối lấy khoản 10 micro dịch tiết nhỏ lên lam kính để khô ở nhiệt độ phòng. Tiêu bản âm đạo được nhuộm bằng dung dịch xanh methylen 0,5%, đọc trên kính hiển vi ở vật kính 40x để xác định sự có mặt của các loại tế bào [7], [8], [9]. Chuột được coi là cắt buồng trứng hoàn toàn khi trên mẫu tế bào âm đạo chỉ xuất hiện chủ yếu tế bào đa nhân và một ít tế bào biểu mô. Các chuột vẫn còn sự xuất hiện tế bào sừng được coi là cắt buồng trứng chưa đạt và được loại khỏi nghiên cứu.

Bước 3: Đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của chế phẩm.

Chuột cắt buồng trứng đạt yêu cầu (sau sàng lọc bước 2z0 được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 9 – 10 con.

Lô 1 (chứng bệnh): uống nước cất với thể tích 1ml/100g.

Lô 2 (lô chứng dương): tiêm dưới da estradiol với liều 2mg/kg.

Lô sắn dây củ tròn – 1: Uống cao sắn dây củ tròn với liều 100mg/kg.

Lô sắn dây củ tròn – 2: Uống cao sắn dây củ tròn với liều 200mg/kg.

Động vật thí nghiệm được uống chế phẩm nghiên cứu hoặc nước cất liên tục trong 14 ngày, mỗi ngày một lần vào 9 giờ sáng. Lấy mẫu tế bào âm đạo vào 8 – 10 giờ sáng liên tục trong 4 ngày đầu sau uống chế phẩm và sau đó 2 ngày một lần để kiểm tra sự có mặt của các loại tế bào âm đạo. Quy trình tiến hành tương tự như bước sàng lọc ở trên, Chế phẩm thử được coi là có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen khi làm tăng sự xuất hiện tế bào sừng so với lô chứng.

Thông số đánh giá.

  • Ngày đầu tiên xuất hiện tế bào sừng.
  • Phần trăm tế bào sừng: lấy ngẫu nhiên một vi trường, xác định tỉ lệ % tế bào sừng trên tổng số các loại tế bào trên vi trường vào các ngày 4 ,7, 14 ngày sau uống chế phẩm nghiên cứu thông qua thang điểm.
  • Sự tăng trưởng tế bào âm đạo trong 14 ngày sau uống chế phẩm nghiên cứu.

Xử lý số liệu: Dữ liệu được lưu trữ, phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 và được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình +_ sai số chuẩn. Mẫu được kiểm định bằng test phi tham số Krusal – Walls sau đó là Mann – Whitlney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô.

Kết quả nghiên cứu:

Ảnh hưởng của sắn dây củ tròn đến ngày đầu tiên xuất hiện tế bào sừng.

Sự có mặt các tế bào âm đạo sau khi dùng các chế phẩm được thể hiện ở bảng 1.

Ảnh hưởng của sắn dây củ tròn trên tỉ lệ % tế bào sừng.

Tỉ lệ phần trăm tế bào sừng âm đạo sau khi dùng các chế phẩm.

Sau khi cho uống chế phẩm nghiên cứu:

+ Lô chứng beejh: Không có sự thay đổi về tế bào âm đạo trong suốt thời gian nghiên cứu, tế bào chủ yếu là bạch cầu đa nhân, có một ít tế bào biểu mô. Đánh đánh giá trung bình từ 0 -1.

+ Lô estradiol: Sự có mặt của tế bào sừng xuất hiện bắt đầu vào ngày thứ 2,2 sau khi dùng thuốc và duy trì suất 14 ngày uống thuốc.

+ Lô dùng sắn dây củ tròn: Sự có mặt của tế bào sừng xuất hiện bắt đầu vào ngày thứ 2,0 với sau khi uống SDCT liều 100mg/kg và ngày thứ 2,3 với SDCT liều 200mg/kg và duy trì suốt 14 ngày uống. Điểm đánh giá trung bình cho sự xuất hiện các loại tế bào sừng hoặc chủ yếu tế bào sừng.  Tỉ lệ xuất hiện tế bào sừng vào ngày thứ 4 sau ở 2 mức 100mg/kg, 200mg/kg lần lượt là 75,66% và 87,34% không có sự khác biệt giữa các mức liều về thời gian bắt đầu xuất hiện tế bào sừng cũng như tỉ lệ tế bào xuất hiện vào các ngày 4, 7, 14 sau khi dùng chế phẩm.

Bàn luận

Thử nghiệm đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng là một hệ thống thử nghiệm trên động vật trong đó trục dưới đồi – tuyến yên – buồng trứng bị mất chức năng, dẫn đến hàm lượng estrogen nội sinh lưu thông trong máu ở mức độ thấp tương ứng pha không động dục ở động vật bình thường. Việc tiêm dưới da estradiol với liều 2mg/kg đã làm tăng nồng độ estradiol máu dẫn đến kích thích tăng trưởng tế bào âm đạo, làm tăng khả năng sinh sản của tế bào sừng, một loạt tế bào chỉ xuất hiện do tác dụng của estrogen, thường có mặt vào chu kì bình thường. Những thuốc có hoạt tính estrogen cũng sẽ có tác dụng kích thích sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo, dẫn đến tăng trưởng số lượng tế bào sừng. Do vậy, đánh giá sự có mặt tế bào sừng sẽ giúp đánh giá hoạt tính estrogen của thuốc nghiên cứu.

Kết luận

Cao sắn dây củ tròn ở 2 mức liều thứ là 100mg/kg và 200mg/kg có hoạt tính estrogen thể hiện qua việc làm tăng khả năng xuất hiện tế bào sừng trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng.

Comments

comments

Nghiên cứu tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen thông qua sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo động vật thí nghiệm của sắn dây củ tròn ( Pueraria candillei  var mirifica (Airy Shaw & Suvat) Niyomdaham)

Trả lời

Email của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *